Лабораторные методы исследования крови, мочи у мелких домашних животных
СОДЕРЖАНИЕ: Специальные методы исследования крови и мочи животных. Условия взятия крови и мочи, сохранность до начала лабораторных исследований. Скорость оседания эритроцитов и содержания гемоглобина. Определение времени свертываемости крови по способу Бюркера.1. Исследование крови животных
К специальным методам исследования крови прибегают в тех случаях, когда необходимо и возможно установить диагноз на уровне изучения морфологических характеристик клеток в мазке или изменения их функциональных свойств под воздействием различных факторов. В первом случае исследования ведут с использованием цитохимических красителей, специфически реагирующих с определенными включениями или компонентами клеток; функциональные свойства клетки определяют как ответ на физико-химические воздействия [6].
1.1 Правила взятия крови у животного
Условия взятия крови и ее сохранность до начала лабораторных исследований имеют важное значение при получении достоверных результатов. Во многом эти результаты зависят от техники взятия крови и используемых при этой инструментов. В организме различает артериальную, венозную и капиллярную кровь, которая имеет незначительные цитологические и биохимические отличия. Для морфологических исследований пользуются почти исключительно капиллярной кровью, а при биохимических – венозной.
Капиллярную кровь берут из внутренней поверхности ушной раковины. Шерсть на месте взятия крови выстригают, очищают место укола ватным тампоном, смоченным спиртом-эфиром. Укол делают на глубину до 2 мм. Первую каплю крови стирают, т.к. она содержит случайные примеси и лимфу, а последующие берут для исследования. Очень важно, чтобы кровь вытекала из ранки без надавливания на ткани, иначе она смешивается с лимфой и изменяет свой клеточный и биохимический состав. Истечение крови можно ускорить, если предварительно прогревать место укола в теплой воде или источником сухого тепла (фен, электролампа).
При венепункции прокол окружающих вену тканей и стенки вен делают в один прием. Иглы для взятия крови должны быть с коротким срезом и достаточно большим диаметром, чтобы не травмировать противоположную стенку вены и не вызвать повреждения эритроцитов. Предварительно иглы стерилизуют кипячением в 1%-ом растворе бикарбоната натрия, место вкола обрабатывают аналогично получению капиллярной крови.
При взятии крови из яремной вены иглу вкалывают на границе перехода верхней трети шеи в среднюю. Чтобы вызвать достаточное наполнение вены и уменьшать ее подвижность, вену сдавливает в середине шеи резиновым жгутом или пальцем. При проколе вены необходимо держать иглу в руке так, чтобы направление ее совпало с линией хода вены и чтобы срез иглы был направлен вверх, к голове. Иглу вкалывают под острым углом – в 20–30°. При попадании в вену из иглы вытекает кровь.
Кровь должна стекать по стенке пробирки по избежании разрушения эритроцитов и при необходимости немедленно смешиваться с достаточным количеством антикоагулянта.
Перед извлечением иглы из вены резиновый жгут снимают, пережимают вену пальцем выше места вкола, иглу извлекают, а место вкола некоторое время сдавливают тампоном для предотвращения образования гематомы. В заключении область венепункции дезинфицируют настойкой йода и заливают Колодием [3].
В зависимости от характера исследований готовят определенное количество пробирок. Стенки стеклянной посуды способны обмениваться ионами с кровью, а следы моющих средств и поврежденные пробирки влияют на активность, ферментов. Это можно исключить, если использовать пластмассовые, пробирки одноразового пользования; для некоторых исследований стенки стеклянных пробирок покрывают слоем парафина или силиконового масла.
В зависимости от задач исследования анализу подвергают цельную кровь, плазму или сыворотку.
В цельной крови определяют морфологические показатели, а также содержание глюкозы, кетоновых тел, меди, цинка, кобальта, марганца, селена и др., т.е. веществ, равномерно распределенных между плазмой и эритроцитами. Для исследования веществ, неравномерно распределенных между клетками и жидкой частью крови, следует использовать сыворотку или плазму. В сыворотке, например, исследуют общий белок и его фракции, остаточный азот, мочевину, свободные аминокислоты, липиды, холестерин, билирубин, кальций, неорганический фосфор, магний, йод, связанный с белком (СБЙ), каротин, витамины, ферменты и др. В плазме – резервную щелочность, содержание натрия, калия, неорганического фосфора, магния, каротина, витаминов А, С и др.
Для получения пробы цельной крови или плазмы ее стабилизируют, т.е. в пробирку вносят противосвертывающее вещество – антикоагулянт. Антикоагулянты лучше применять в виде растворов.
Для получения сыворотки пробирки с кровью рекомендуется в процессе взятия крови помещать в термостат с температурой до 38°С. При массовых обследованиях животных таким импровизированным термостатом может быть достаточная емкость с водой указанной температуры. После завершения работ по взятию крови, свернувшиеся пробы обводят тонкой спицей из нержавеющей стали для лучшего отделения сыворотки и ставят в термостат при 37–38°С на 1–2 часа для окончательного отделения сыворотки. Сыворотку сливают и центрифугируют 20 минут при 2000–3000 об/мин.
Для получения плазмы кровь с антикоагулянтом центрифугируют 20–30 минут при 2000–3000 об/мин. Плазма крови отличается от сыворотки наличием фибриногена.
Цельную кровь, плазму и сыворотку для непродолжительного хранения помещают в холодильник (+2…+4°С), длительное хранение сыворотки требует температуры – 20°С.
Нарушение условий хранения проб может стать причиной погрешностей анализа. В результате длительного стояния сыворотки, над эритроцитами могут наступить сдвиги в концентрации ряда компонентов: повышается концентрация калия, активности кислой фосфатазы, аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, гидроксибутиратдегидрогеназы, понижается содержание глюкозы вследствие гликолитических процессов. При температуре около 20°С в цельной крови возрастает содержание аммиака, многие ферменты даже при температуре холодильника быстро теряют свою активность (креатинкиназа, кислая фосфатаза), в лактатдегидрогеназа, напротив, быстрее теряет активность при низких температурах [3].
Возникший при взятии или хранении гемолиз эритроцитов приводит к повышению концентрации калия, активности кислой фосфатазы, аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, гидроксибутиратдегидрогеназы. Неумелое встряхивание проб при перемешивании их содержимого или при транспортировке также может вызвать гемолиз эритроцитов.
При проведении специальных исследований нужно внимательно следить за выполнением особых, оговоренных в описании методик правил взятия, консервации и хранения проб крови [5].
1.2 Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) – неспецифический лабораторный показатель крови, отражающий соотношение фракций белков плазмы; изменение СОЭ может служить косвенным признаком текущего воспалительного или иного патологического процесса. Проба основывается на способности эритроцитов в лишенной возможности свёртывания крови оседать под действием гравитации. В норме величина СОЭ у собак не превышает 2–5 мм/час, а у кошек – 6–10 мм/час.
Принцип метода заключается в следующем. Удельная масса эритроцитов превышает удельную массу плазмы, поэтому они медленно оседают на дно пробирки. Скорость, с которой происходит оседание эритроцитов, в основном определяется степенью их агрегации, то есть их способностью слипаться вместе. Из-за того, что при образовании агрегатов уменьшается отношение площади поверхности частиц к их объёму, сопротивление агрегатов эритроцитов трению оказывается меньше, чем суммарное сопротивление отдельных эритроцитов, поэтому скорость их оседания увеличивается. Агрегация эритроцитов главным образом зависит от их электрических свойств и белкового состава плазмы крови. В норме эритроциты несут отрицательный заряд и отталкиваются друг от друга. Степень агрегации (а значит и СОЭ) повышается при увеличении концентрации в плазме так называемых белков острой фазы – маркеров воспалительного процесса. В первую очередь – фибриногена, C-реактивного белка, церулоплазмина, иммуноглобулинов и других. Напротив, СОЭ снижается при увеличении концентрации альбуминов.
Определение СОЭ проводят методом Панченкова (в капилляре). В методе Панченкова в качестве антикоагулянта используют цитрат натрия. В капилляр набирают 2,5 мкл цитрата и в тот же капилляр добирают 7,5 мкл крови или в заранее раскапаные пробирки с цитратом добавляют 7,5 мкл крови, кровь с цитратом перемешивают в пробирке, снова набирают в капилляр и устанавливают в специальный штатив на 1 час. По методу Вестергрена (в пробирке).
В градуированный на 100 делений капилляр Панченкова набирают до метки «Р» 5%-ый раствор цитрата натрия и переносят его на часовое стекло. Затем в тот же капилляр набирают дважды кровь до метки «К» и оба раза выдувают её на часовое стекло. Кровь, тщательно перемешанную с цитратом натрия, вновь набирают в капилляр до метки «К». Капилляр ставят в штатив строго вертикально. СОЭ учитывают через 1 час, при необходимости через 24 часа и выражают в миллиметрах.
Более ста лет данный лабораторный тест применяется для количественного определения интенсивности разнообразных воспалительных процессов. Так, чаще всего увеличение СОЭ связано своспалительными процессами, отравлениями, инфекциями, инвазиями, опухолями, гемобластозами, кровопотерей, травмами, оперативными вмешательствами.
Хотя воспаление и является наиболее частой причиной ускорения оседания эритроцитов, увеличение СОЭ также может обусловливаться и другими, в том числе и не всегда патологическими, состояниями [9].
Несмотря на свою неспецифичность определение СОЭ все еще является одним из наиболее популярных лабораторных тестов для установления факта и интенсивности воспалительного процесса.
1.3 Определение содержания гемоглобина
Определение содержания гемоглобина в крови животных является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гену различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора [3].
Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь животного – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа [1].
Повышение: некоторые формы гемобластозов, в частности эритремия, обезвоживание организма.
Понижение (анемия): различные виды анемий, в том числе вследствие кровопотери.
Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3–5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.
Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму – гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.
При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г./л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.
При определении гемоглобина двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа [7].
Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99. Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.
Выполнение. В сухие чистые пробирки дозатором внести по 5 мл трансформирующего раствора, к ним прилить по 20 мкл крови поверенной пипеткой Сали или механическим дозатором со всеми предосторожностями, перечисленными в предыдущем разделе. Пробу тщательно перемешать на микровстряхивателе или вручную до достижения гомогенного раствора. Растворы выдержать при комнатной температуре время, указанное в инструкции к набору, и измерить оптическую плотность растворов на поверенном, калиброванном приборе в кювете, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной (с длиной оптического пути 10 мм). Окраска растворов устойчива до 5 час и более, что позволяет проводить измерения в любое удобное время в этом временном интервале. Расчет содержания гемоглобина в крови произвести по калибровочному графику или фактору, определенному на данном приборе. Если соблюдены все перечисленные условия подготовки и проведения анализа, описанные выше, погрешность определения гемоглобина в крови не будет превышать ±2%. Кратко суммируем источники возможных ошибок при определении гемоглобина: использование некалиброванных пипеток и несовершенная техника дозирования проб крови; применение неповеренного оборудования, не обеспечивающего линейную зависимость оптической плотности от концентрации гемоглобина в требуемой области измерений; нестабильность прибора; отсутствие внутрилабораторного контроля качества; недостаточная чистота кювет, особенно проточных; ошибки при построении калибровочных графиков и расчете факторов; использование контрольных растворов гемоглобина низкого качества; ошибки оператора, ошибки, допускаемые на преаналитической фазе [6].
1.4 Количественные характеристики клеток крови
Определение количества клеток крови проводится различными методами: с помощью счетных камер, в мазках крови (подсчет тромбоцитов на определенное количество эритроцитов), с помощью автоматических устройств. Во всех случаях результаты представляются в виде количества клеток в единице объема крови. По международной системе единиц (СИ) число форменных элементов в крови выражают в расчете на 1 л [2].
Подсчет клеток с помощью счетных камер является наиболее распространенным микроскопическим методом. Он основан на использовании разведенной крови, внесенной в счетную камеру. Все форменные моменты подсчитывается по единому принципу, различие заключается в степени разведения крови и применения, различных по составу разбавителей для эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.
Использование счетных камер делает метод достаточно трудоемким для лабораторных исследований. На точности метода сказывается ошибки при взятии крови, разбавлении ее, неравномерности заполнения камер, нарушение правил подготовки камер к работе и подсчета клеток. Метод требует большого и постоянного напряжения при работе с микроскопом и особенно утомителен при подсчете эритроцитов и тромбоцитов. В то же время камерный метод может быть применен в любых условиях, не требует сложного оборудования и дефицитных реактивов [8].
Подсчет тромбоцитов в мазках крови объясняется их малыми размерами и недостаточной четкостью контуров при подсчете в счетной камере. Тромбоциты считаются на определенное количество эритроцитов в мазке (чаще на 1000 эритроцитов) с последующим пересчетом на 1 л крови.
Использование фотометрических или кондуктометрических принципов позволило создать автоматические счетчики и гематологические автоматы для лабораторных исследований. Форменные элементы крови либо перекрывают световой луч специального сканирующего микроскопа, либо изменяют сопротивление между электродами капилляра, по которому протекает разбавленная кровь, при этом возникает импульс, регистрируемый счетным устройством [2].
Гематологические счетчики и автоматы значительно повышают производительность труда и точность исследований, позволяют определять параллельно 7–8 параметров. В то же время высокая стоимость таких аппаратов, специальные требования к качеству реактивов, высокая производительность и жесткость программ делают рентабельным их использование лишь в условиях крупных лабораторий и стационаров.
Количество эритроцитов и лейкоцитов в крови здоровых животных колеблется в широких пределах (табл. 1.4).
Таблица 1.4. Общий анализ крови
| Гемоглобин % | Эритроциты, млн./мкл | Цветной показатель | Лейкоциты, тыс./мкл | Лейкограмма | ||||||||
| Б | Э | М | Ю | П | С | Л | Мо | |||||
| Собаки | 120 – 180 | 5,0 – 8,0 | 0,9 – 1,1 | 8 – 17 | 0–1 | 2–10 | - | - | 1–3 | 43–71 | 12–30 | 3–10 |
| Кошки | 90 – 167 | 5,2 – 10,9 | 0,9 – 1,1 | 4 – 17 | 0–1 | 2–12 | - | - | 3–6 | 40–45 | 20–55 | 1–4 |
| СОЭ собаки 2–5 мм/ч; СОЭ кошки 6–10 мм/ч | ||||||||||||
Уменьшение числа эритроцитов ниже нормативных показателей является одним из основных лабораторных симптомов малокровия (анемии) [5]. Необходимо отметить, что при анемиях не всегда наблюдается уменьшение количества эритроцитов в крови, т. к. анемия – это уменьшение концентрации гемоглобина в единице объема и, следовательно, при нормальном количестве эритроцитов возможно снижение концентрации в них гемоглобина. Для уточнения характера анемии, кроме анамнеза и клинических данных, необходимы сведения о количестве эритроцитов, концентрации гемоглобина, величине гематокрита, количестве ретикулоцитов, расчетных индексах эритроцитов, морфологии эритроцитов, их объеме и диаметре [8].
Увеличение числа эритроцитов (эритроцитоз, полицитемия) может наблюдаться при уменьшении объема циркулирующей плазмы (гемоконцентрационный, относительный эритроцитоз), а также при активации эритропоэза (абсолютный эритроцитоз) [2].
1.5 Определение времени свертываемости крови по способу Бюркера
На часовое стекло наносят каплю прокипяченной дистиллированной воды и к ней прибавляют каплю крови, добытую уколом из мякоти пальца (следует взять вторую каплю, так как к первой примешивается тканевая жидкость, замедляющая свертывание). Точно отмечается время взятия крови. Тонкой стеклянной палочкой смешивают обе капли. Затем часовое стекло помещают в чашку Петри, на дне которой лежит кусочек смоченной водой фильтровальной бумаги; чашка Петри играет роль влажной камеры. Лучше всего производить исследование при температуре 25°С. Каждые полминуты к краю капли приставляют тоненький кончик вытянутой в нить стеклянной палочки, продвигают к центру капли и, сделав внутри капли несколько все более увеличивающихся спиральных завитков от центра к периферии, вынимают затем из капли. Каждый раз палочку моют и тщательно вытирают досуха. Началом свертывания считается тот момент, когда вслед за вынутым из крови кончиком стеклянной палочки потянется нить фибрина. В норме это происходит через 5–9 мин после взятия капли крови [4].
2. Исследование мочи животных
Исследование мочи является важнейшей процедурой для характеристики общего состояния здоровья пациента и, особенно, почечной функции. В составе диагностического плана анализ мочи оказывает помощь врачу-практику в идентификации самых разнообразных системных заболеваний. Несмотря на всю простоту выполнения, анализ мочи часто проводится неправильно, а полученные результаты ошибочно интерпретируются. Поэтому необходимо твердо придерживаться принципа гарантии качества, а результаты химического исследования мочи и осадка необходимо интерпретировать в сочетании со значениями удельного веса.
Метаболические функции почек играют важную роль для жизни, но моча является продуктом почечной деятельности, легкодоступным для простого, недорогого и быстрого анализа. Клинический анализ мочи включает в себя оценку физических и химических характеристик мочи: анализ содержащихся в моче твердых веществ, других растворенных веществ и микроскопическое исследование осадка мочи [4].
2.1 Правила взятия мочи у животного
исследование кровь моча животное
Существует три обычных метода сбора мочи, а именно, прокол мочевого пузыря, катетеризация и сбор мочи, выделяющейся из организма естественным путем. Выбор метода оказывает влияние на результаты анализа. Последние два из вышеперечисленных методов в большей степени подвержены риску бактериального заражения по сравнению с перфорацией мочевого пузыря. Выделяющаяся из организма естественным путем моча также отражает изменения, произошедшие как в почках, так и в нижних отделах мочеполовых путей.
Методика подготовки животного зависит от метода отбора проб мочи. Уретральная катетеризация связана с наибольшим риском бактериального заражения. Для проведения катетеризации требуется асептическая методика, включая использование стерильного катетера. Для снижения возможности бактериального заражения некоторые практикующие врачи после сбора мочи проводят инфузию антибиотических средств в мочевой пузырь. Отсутствие необходимой квалификации для проведения катетеризации маленьких собак может быть причиной, по которой многие практикующие врачи не проводят исследование мочи.
Прокол мочевого пузыря – это более предпочтительный метод сбора мочи. Преимущество этого метода заключается в том, что интерпретация результатов анализа мочи ограничивается почками и мочевым пузырем. Кроме того, методика перфорации мочевого пузыря при приготовлении бактериальной культуры мочи позволяет избежать заражения образца флорой нижних отделов мочеполовых путей. Прокол мочевого пузыря можно проводить у пациентов всех размеров. Для этой процедуры не требуется особой квалификации, и она не связана с высоким риском бактериального заражения пациентов, склонных к циститу, приводящего к таким заболеваниям как несептический уролитиаз (мочекаменная болезнь).
Неудобством метода прокола мочевого пузыря является загрязнение образца кровью, выделяющейся при прохождении иглы через стенку органа. Этого можно избежать путем применения тройного клапана и отбрасывания первых нескольких миллилитров мочи, загрязненной содержимым иглы. У животных с подозрением на гематурию следует проводить анализ проб мочи, выделяющейся из организма естественным путем, и проб мочи, полученных методом прокола мочевого пузыря. Метод прокола мочевого пузыря должен использоваться только тогда, когда мочевой пузырь прощупывается и содержит мочу.
Методика получения образца мочи путем естественного мочеиспускания подразумевает определенную подготовку животного. Проба, взятая в середине процесса мочеиспускания, характеризуется меньшим риском бактериального заражения, возникающего вследствие контакта мочи с участками вокруг наружного отверстия и конечных отделов мочеиспускательного канала [4].
2.2 Физическая и визуальная оценка
Физические характеристики включают в себя измерение объема, фиксирование цвета, прозрачности или мутности, а также удельного веса (SpG) мочи. За исключением удельного веса, все вышеперечисленные характеристики устанавливаются визуально. Объем мочи, образуемой за данный период времени, – это еще один источник информации о почечной функции. Побочное определение состояния гидратации и удельного веса мочи являются наиболее чувствительными индикаторами состояния почечной функции при проведении клинического анализа мочи. Значение удельного веса (SpG) мочи, равное примерно 1,010 изостенурического гломерулярного фильтрата, является показателем способности почек сохранять или выделять воду. У пациентов с нормальной степенью гидратации с низким или нормальным уровнем содержания азота мочевины в плазме и степенью изостенурии почки функционируют нормально, секретируя воду. У обезвоженных, страдающих гиперазотемией с изостенурией пациентов почечная функция, по-видимому, поставлена под угрозу. Вопрос о том, является ли данное изменение первичной или вторичной дисфункцией, решается путем подробного ознакомления с клинической историей заболевания, записями терапевта и проведения дополнительных лабораторных исследований или повторного анализа мочи. Повышенное мочеобразование с низкими значениями удельного веса имеет место при первичной почечной недостаточности и вторичных нарушениях, таких как сахарный диабет, пиометрит (скопление гноя в полости матки) и гиперкортицизм (гиперфункция коры надпочечников), а также при использовании терапевтических диуретиков и кортикостероидов [2].
Нормальная моча кошек и собак бесцветная или имеет светло-желтую окраску в зависимости от соотношения в моче растворенных веществ и растворителя. Более темный цвет нормальной мочи является показателем высокой концентрации раствореного в моче урохрома, а, следовательно, и более высоких значений удельного веса (SpG). Темно-желтая моча содержит высокую концентрацию урохромов, а, следовательно, характеризуется так же высокими значениями SpG. При длительных тренировках контрольных упряжных и охотничьих собак их тренеры судят о состоянии гидратации собак по цвету их мочи. Патологические состояния, диета и прием лекарственных препаратов (например, сульфамидных препаратов) могут изменять цвет мочи. Если моча имеет розовый, красный, коричневый или черный цвет, это указывает на гемоглобинурию или миоглобинурию при миолизисе. Голубая или зеленая окраска мочи позволяет предположить билирубинурию. Окраска хранящейся мочи постепенно изменяется от темно-желтого до темно-зеленого цвета вследствие окисления билирубина и уробилиногена до биливердина и уробилина, соответственно [6].
Мутность свежесобранной мочи является признаком наличия в моче суспендированных эпителиальных клеток, крови, лейкоцитов и бактерий. Охлаждение свежесобранной, концентрированной прозрачной мочи до комнатной температуры или охлаждение в холодильнике приводит к помутнению пробы мочи, поскольку растворимость высококонцентрированных мочевых солей понижается, и они выпадают в осадок. При исследовании мутной мочи под микроскопом видны кристаллы фосфата. Поэтому перед проведением исследования мочи необходимо довести температуру образца мочи до значений комнатной температуры [1].
2.3 Химический анализ мочи
Значение удельного веса мочи имеет большое значение для интерпретации результатов химического анализа и исследований осадка. Многие пациенты потребляют постоянное количество твердой пищи, но воду могут получать по желанию. Это приводит обычно к широкому диапазону различий между значениями очищения воды в почках и, в свою очередь, разбавлению различных растворенных в моче веществ. Таким образом, как показывают результаты химического анализа мочи, количество выводимой воды оказывает большее влияние на концентрацию растворенных веществ или осадка, чем на общее количество образуемого специфического растворенного вещества. Например, моча, удельный вес которой составляет 1,020, содержит вдвое более высокую концентрацию растворенного вещества по сравнению с мочой, удельный вес которой составляет 1,010. Моча с удельным весом 1,030 содержит втрое более высокую концентрацию растворенного вещества по сравнению с мочой, удельный вес которой равен 1,010. Таким образом, протеинурия 1+ в моче с удельным весом 1,010 – это то же самое количество белка, что и 2+ при значении удельного веса 1,020 или 3+ при 1,030.
Для проведения анализа мочи можно использовать самые разнообразные выпускаемые промышленностью индикаторные бумажные полоски. Некоторые могут использоваться для осуществления большего числа тестов, чем другие, но не все тесты применимы к ветеринарной практике. Обычный ветеринарный анализ мочи включает в себя определение значения рН, содержания белков, глюкозы, кетонов, билирубина и крови в моче.
Методика использования сухих реактивов в процедуре с применением измерительного стержня удобна, но часто применяется неправильно. Каждый отдельный тампон с реагентами на палочке содержит полуколичественный химический колориметрический образец, который при контакте с мочой в течение определенного периода времени должен пройти визуальную классификацию по цвету. Для обеспечения стабильности реактивов необходимо строго учитывать время истечения срока хранения реактивов. Солнечные лучи, влажная среда и тепло ускоряют процесс порчи химического реактива. Надежные результаты могут быть получены только при твердом соблюдении в каждом тесте соответствующего инкубационного периода. Особую информацию об образцах можно получить, изучив вкладыш, прилагаемый к упаковке производителем. Обычная практика вынимания измерительных стержней из бутыли приводит к абсорбции сухими реагентами влаги из воздуха и к их порче.
Образцы подразделяются на следующие классы и выражаются в следующих единицах: 0, следы, 1+, 2+, 3+, и 4+ или в мг/дл. Способность классифицировать по цвету у разных людей сильно различается; люди с цветовой ахроматопсией сталкиваются с трудностями в классифицировании изменений цвета. Лучше пользоваться методикой фиксирования результатов с помощью шкалы от 0 до 4+, чем, выражая изменения цвета в единицах мг/дл, поскольку первый способ поддерживает полуколичественный характер данного анализа, в то время как последний создает ложное чувство уверенности в чувствительности, данной процедуры [1].
Белки. Результаты анализа белков мочи должны интерпретироваться на базе значений удельного веса. Протенурия 1+ у собак с удельным весом мочи SpG более 1,035 является нормой, тогда как устойчивое значение 1+ белков с SpG менее 1,035 требует дальнейших исследований. В отсутствие гематурии / пиурии (наличия гноя в моче) происхождение устойчивой протеинурии связано: с повышенным содержанием гломерулярно-отфильтрованного альбумина, обусловленным повышенным гидростатическим давлением, гломерулонефритом или гломерулярным амилоидозом (амилоидной дистрофией); нарушением механизма абсорбции в почечных канальцах (в основном с мягкой протеинурией) при хроническом интерстициальном (межуточном) нефрите или врожденной панцитопенией (анемией или синдромом Фанкони); с повышением гломерулярной экскреции белков, связанной с незлокачественной и злокачественной гиперглобулинемией, включая миелому клеток плазмы, при которой выводится белок Бенс-Джонса. Другие причины протеинурии включают в себя стресс, лихорадочное состояние, физическую нагрузку и гипертермию (перегревание организма).
В ветеринарной лаборатории должны проводиться как колориметрические, так и нефелометрические исследования (т.е. тест на преципитацию с сульфосалициловой кислотой – APT). При проведении процедуры определения белков с помощью измерительного стержня применяется цветовой индикатор тетрабромфенол, который при значении pH 3 изменяет цвет от желтого до синего. Результаты выражаются в баллах: следы, 1+, 2+, 3+ или 4+. Будучи надежным для определения альбумина, метод определения белков с помощью измерительного стержня, не определяет глобулины или белки Бенс-Джонса при множественной миеломе. Ложно-положительные результаты – это обычное явление, которое обусловлено истощением буферности реагентного тампона вследствие длительного контакта реактива с высоко-буферной, щелочной или загрязненной (антисептиками, такими как хлоргексин или детергентные вещества) мочой. Ложно-положительные результаты настолько часто получаются, что необходимо подтверждать все положительные результаты анализа белков с применением измерительного стержня с помощью теста APT (рис. 2.3.)Нефелометрическое исследование APT представляет собой очень простую процедуру, при которой помутнение, возникающее в результате смешивания равных частей мочи и раствора сульфосалициловой кислоты, оценивается по шкале: 0, следы, 1+, 2+, 3+ и 4+. Данная кислота относится к разряду слабых кислот, безопасна при хранении, при работе с ней пользуются теми же инструментами, что и измерительный стержень, она продается в форме таблеток, которые можно растворить в определенном объеме воды [1].
Для проведения этого теста требуется 5% раствор сульфосалициловой кислоты. Тест осуществляется путем смешивания равных частей мочи и данного раствора. Слева направо: отрицательный белок в моче, 2+ белок, характеризующийся определенной мутностью, и 4+ белок, который обнаруживается в виде осадка.
Значения pH . рН мочи собак и кошек варьируют между 5,5 и 7. Значения pH изменяются в зависимости от диеты: животные, которых содержат на диете с высоким содержанием мяса, склонны иметь кислую мочу вследствие выведения с мочой большого количества сульфатных и фосфатных солей, тогда как моча животных, содержащихся на диетах богатых овощами, имеет щелочную среду. Транзиторное понижение кислотности мочи после приема пищи сопровождается повышением значения pH мочи. Некоторые бактерии, населяющие мочевые пути, обладают способностью расщеплять мочу с формированием аммиак-образующей щелочной мочи. В этих случаях изменение или отсутствие изменений pH может свидетельствовать об успешной или неуспешной терапии, или о рецидиве инфекции мочевых путей.
Глюкоза. Глюкоза, которая имеет большое значение для жизни, хорошо сохраняется в организме и отсутствует в моче нормальных животных. Любая глюкозурия должна пройти тщательную оценку с целью выяснения, носит ли она стойкий, периодический или временный характер. Наличие глюкозы в моче отражает аккумулятивный клиренс глюкозы почками за определенный период времени, тогда как значения содержания глюкозы в крови находятся в динамическом состоянии и характеризуют содержание глюкозы в крови в данной точке в данный момент времени. Периодическая и временная формы глюкозурии связаны с более высокими значениями содержания глюкозы в крови, чем при пороговой временной гипогликемии (примерно 180 мг/дл), которая возникает после приема пищи.
Временная физиологическая глюкозурия, вызванная стрессом, более ярко выражена у кошек, чем у собак, и может быть причиной транзиторной глюкозурии. Эта транзиторная глюкозурия часто проявляется в форме эугликемии, если данное животное перенесло какой-то стресс, например, было сбито машиной за несколько часов до того, как были взяты пробы мочи и крови. Патологическая глюкозурия сахарного диабета сопровождается стойкой гипергликемией. При преддиабете имеет место перемежающаяся глюкозурия при устойчивом нормальном содержании глюкозы в плазме [1].
У собак и кошек периодическая или транзиторная гипергликемия и глюкозурия являются обычными явлениями при преддиабете, возникающем после приема пищи, преддиабете, который лечится стероидами, и преддиабетах со стресс-индуцированной печеночной гликогенолитической транзиторной гипергликемией, вызванной травмой. Самопроизвольный и терапевтический гиперкортицизм указывает на наличие преддиабетического состояния. Перед тем, как отклонить диагноз перемежающейся глюкозурии как транзиторного заболевания, необходимо исключить диагноз преддиабета либо на основании истории стресса, либо путем измерения уровня глюкозы в плазме через два часа после кормления. Глюкозурия ослабленной реабсорбции в почечных канальцах встречается редко и обычно сопровождается умеренной протеинурией синдрома Фалькони (собаки Basenji) или проявляется в форме приобретенной дисфункции почечных канальцев у пациентов, страдающих от аминогликозидного отравления [4].
Билирубин. Билирубинурия часто наблюдается в концентрированной моче нормальных собак, но не обнаруживается у кошек и у большинства других видов. В результате того, что в норме у собак имеет место низкий критический уровень экскреции билирубина, билирубинурия от следов до 1+ считается нормой при исследовании методом измерительных стержней. В моче содержится только связанный билирубин. Гипербилирубинурия обнаруживается при заболевании печени, непроходимости желчных протоков, желчекаменной болезни (холелитиазе) и гемолизисе. У собак тяжелая форма билирубинурии предшествует гипербилирубинемической гепатопатии. У собак с тяжелой формой гемоглобинемии, сопровождающей внутрисосудистый гемолизис, происхождение некоторого количества мочевого билирубина может быть обусловлено билирубином, связанным почками и печенью.
При билирубинурии используется другая процедура, результаты которой следует интерпретировать на базе значений концентрации мочи (т.е. ее удельного веса). Необходимо использовать свежесобранные пробы мочи, поскольку билирубин постепенно окисляется до биливердина [1].
2.4 Микроскопическое исследование мочи
Клетки в моче. При исследовании осадка мочи в норме обнаруживаются 0–3 в поле зрения лейкоцитов, 0–3 в поле зрения эритроцитов. Повышенное количество лейкоцитов в моче называется пиурией, свидетельствует о воспалении. Пиурия часто обусловлена бактериальной инфекцией. Появление большого количества эритроцитов в моче называется гематурией. Частой причиной появления крови в моче являются уролиты.
Эпителиальные клетки в мочевом осадке имеют различное происхождение, их слущивание происходит с органов, покрытых различными видами эпителия (плоского эпителия, переходного эпителия, почечного эпителия). Небольшое количество эпителиальных клеток в моче является нормой, почти всегда в мочевом осадке встречаются клетки плоского эпителия и переходного эпителия. Клетки плоского эпителия, попадающие в мочу из влагалища, наружных половых органов и мочеиспускательного канала особого диагностического значения не имеют. Переходный эпителий выстилает слизистую мочевого пузыря, мочеточников, почечных лоханок, крупных протоков предстательной железы. Повышенное количество клеток переходного эпителия может быть связано с воспалительным процессом, интоксикациях, мочекаменной болезни или опухолью мочевых путей. При обнаружении в осадке мочи конгломератов и пластов эпителиальных клеток, умеренно или значительно различающихся по величине и структур, необходимо дальнейшее исследование для определения возможной злокачественности этих клеток. Тогда из капли осадка мочи делают мазок для цитологического исследования. Единичные в препарате клетки почечного эпителия на фоне нормальной микроскопической картины мочевого осадка не дают основания говорить о патологии. Клетки почечного эпителия можно обнаружить в мочевом осадке при поражении паренхимы почек, интоксикациях, расстройствах кровообращения. Обнаружение клеток почечного эпителия вместе с цилиндрами говорит нам о тяжелом поражении почек [5].
Цилиндры в моче. Представляют собой белковые или клеточные образования канальцевого происхождения, имеющие цилиндрическую форму и различную величину. В мочевом осадке различают гиалиновые, зернистые, восковидные, эпителиальные, эритроцитарные, лейкоцитарные, пигментные цилиндры. В нормальной моче животных можно встретить гиалиновые цилиндры 1–2 в препарате. Цилиндрурия является симптомом поражения почек.
Кристаллурия в моче. В кислой моче оседают кристаллы оксалатов, мочевой кислоты, аморфных уратов, ксантина, цистина, в щелочной моче кристаллы струвита, аморфные фосфаты, карбонаты. По внешнему виду кристаллов при микроскопии осадка мочи можно получить только очень неопределенную информацию, это несовершенная методика, поскольку внешний вид кристаллов изменяется под воздействием многочисленных факторов, для точной идентификации нужны сложные специальные анализы. При идентификации кристаллов нужно точно знать РН мочи, и не забывать, что кристаллы могут сильно различаться по форме. Кристаллурия не является синонимом диагностики уролитиаза у животного, и не является единственным критерием оценки состава камня при наличии уролитов. Даже если у животного с уролитиазом наблюдается кристаллурия, вовсе необязательно, что уролиты образованы из тех же минералов, что и кристаллы, они могут составлять лишь часть уролитов. И у животного с кристаллурией не всегда образуются уролиты. Наиболее часто встречающиеся кристаллы в моче кошек и собак.
Струвиты (трипельфосфаты) представляют собой трех – шести-, восьмигранные призмы, иногда соединяются в структуры типа листа папоротника, Образовываются струвиты в щелочной моче (приложение 2) [1].
2.5 Исследование мочевого осадка
Для исследования мочевого осадка можно провести центрифугирование 5 или 10 мл мочи при низких скоростях центрифугирования (приблизительно 2000 оборотов в минуту) в течение пяти минут. Исследование мочевого осадка можно проводить как во влажном состоянии, так и в сухом состоянии. Препараты мочевого осадка могут быть как окрашенными, так и неокрашенными. Необходимо дать характеристику кристаллов на влажных препаратах. Окрашивание препаратов осадка увеличивает возможности визуализации клеточных элементов. Методу окрашивания отдается предпочтение теми, у кого нет достаточно большого опыта проведения анализа мочи.
Для исследования влажных препаратов мочи существует целый ряд производимых в промышленности красителей (краситель Штейнгеймера-Мальбима, новый метиленовый синий, краситель Райта). Красители судан III или судан IV используются для зрительного наблюдения липидов. Для проведения исследования влажных препаратов капля ресуспендированного в примерно 0,5 мл мочи осадка помещается на предметное стекло и накрывается покровным стеклом. Препарат исследуется под микроскопом, сначала при малых увеличениях (100 Х) для сканирования мочевых цилиндров, а затем при больших увеличениях (400 Х) для полуколичественного анализа эпителиальных клеток, красных кровяных телец, белых клеток крови, микроорганизмов, кристаллов и других элементов (капелек жира, сперматозоидов). Для каждого элемента фиксируется среднее количество, обнаруженное при осмотре десяти полей зрения микроскопа. Методы окраски по Граму и Райту используются для приготовления прочно окрашенных сухих препаратов. Хотя окраска по Граму используется для классификации бактерий, имеет место изменение цвета окрашенного препарата в случае присутствия в моче мертвых бактерий и бактерий в выделениях. Хотя характеристики классификации бактерий с использованием окраски по Гимсу не совпадают с характеристиками окраски по Граму, краситель Гимса хорошо прокрашивает большинство бактерий, что позволяет четче рассмотреть их морфологию и облегчает процесс их обнаружения в сравнении с методом окраски по Граму. Для проведения окраски по Гимсу сухие препараты мочевого осадка после окрашивания промываются. При этом белки плазмы «приклеивают» кровяные клетки к стеклу. Однако, концентрация белков в моче часто недостаточна для сохранения осадка. Для повышения содержания белков в осадке мочи в отфильтрованный осадок можно добавить небольшую каплю бесклеточной плазмы крови. Затем мочевой осадок подвергается ресуспендированию приблизительно в 0,5 мл мочи, и капля полученной суспензии помещается на предметное стекло, как описано для процедуры приготовления мазка периферической крови. Затем препарату перед окрашиванием дают окончательно подсохнуть.
Результаты исследования мочевого осадка следует интерпретировать с учетом метода сбора, значений удельного веса и свежести образца мочи. Образец, полученный методом естественного выделения мочи из организма, может содержать клетки, попадающие в мочу из мочеполовых путей. Задержка с проведением анализа мочи может привести к разрастанию в пробе бактерий или грибов [8].
Заключение
Лабораторные методы исследования в диагностическом отношении не принадлежат к числу специфических, т.е. строго патогномоничных для различных заболеваний. Их использование диктуется необходимостью получения более точных данных о выраженности и динамике патологических изменений в организме больных животных, состоянии функциональных резервных возможностей дыхания, кровообращения, водно-электролитного баланса, питания и белкового обмена, системы гемостаза и эндокринного фона, эндогенной интоксикации, общей сопротивляемости.
К использованию общеклинических методов лабораторного исследования приступают сразу после завершения физикального обследования, а в неотложных ситуациях в ходе его проведения. Наиболее распространенными, выполняемыми в первоочередном порядке являются: изучение показателей крови, анализы мочи и другие.
Данные методы широко применяются для диагностики различных заболеваний и, основываясь на показаниях этих первых, общедоступных приемов, уже с первых часов лечения больных животных с учетом клинических показателей их состояния, можно оценить эффективность, содержание и интенсивность мероприятий по оказанию им помощи.
Список литературы
1. Березов, Т.Т., Коровкин, Б.Ф. Биологическая химия // Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1990 г.
2. Долгов, В.В., Морозова, В.А. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей // В.В. Долгов, В.А. Морозова. – М.: Медицина, 1997 г.
3. Козлов, А.А., Берковский, А.Л., Простакова, Т.М. Клиническая лабораторная диагностика // А.А. Козлов, А.Л. Берковский, Т.М. Простакова. – М.: Мир библиографии. – 1997, №9., – с. 19–20
4. Мейер Д., Харви Д. Ветеринарная лабораторная медицина. Интерпретация и диагностика // Д. Мейер, Д. Харви. – М.: Сфоион, 2007 г.
5. Клинический диагноз – лабораторные основы / Под ред. В.В. Меньшикова, И.И. Дедова. – М.: Медицина, 1987 г.
6. Справочник по клиническим методам исследования / Под ред. Е.А. Кост. – М.: 2е изд., 1975 г.
7. Медицинские лабораторные технологии и диагностика / Под ред. А.М. Карпиценко. – С – Петербург.: Справочник, Т.1, 1998 г.
8. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред. М. Тица. – М.: Династия, 2007